Kvapalné biopsie používajú krvné nádorové tkanivo - na diagnostiku rakoviny
Typicky sa nádory skúmajú pomocou biopsie tkaniva. Malá vzorka je odobratá z nádoru a genotypizovaná alebo analyzovaná na genetický make-up. Problémom s týmto prístupom je, že biopsie nádory môžu byť náročné. Navyše nádorová biopsia poskytuje len snímku nádoru.
Písanie v Discovery Medicine v roku 2015 uvádza Labgaa a spoluautorov o bežnej nádorovej biopsii:
Zo zrejmých dôvodov je ťažké monitorovať vývoj nádoru sekvenčnou biopsiou. Biopsia tiež zrkadlí len jediné miesto nádoru a preto je nepravdepodobné, že by predstavovala celé spektrum somatických mutácií u veľkých nádorov. Alternatívou by bolo získanie viacnásobných biopsií pre ten istý nádor, ale táto možnosť sa nezdá realistická ani presná.
Kvapalinová biopsia zahŕňa meranie cirkulujúcej DNA (ctDNA) a ďalších vedľajších produktov nádoru v krvných vzorkách získaných od pacientov s rakovinou. Tento objavujúci sa diagnostický prístup sľubuje, že bude rýchly, neinvazívny a nákladovo efektívny.
História kvapalnej biopsie
V roku 1948 Mandel a Métais, pár francúzskych výskumníkov, najprv identifikovali ctDNA v krvi zdravých ľudí. Tento objav bol pred jeho časom a až o desaťročia neskôr sa ctDNA ďalej preskúmala.
V roku 1977 Leon a jeho kolegovia prvýkrát identifikovali zvýšené množstvo ctDNA v krvi pacientov s rakovinou.
V roku 1989 Stroun a kolegovia identifikovali neoplastické (tj rakovinové) vlastnosti v krvi. Po týchto objavoch niekoľko ďalších skupín identifikovalo špecifické mutácie tumorových supresorov a onkogénov, mikrosatelitovú nestabilitu a metyláciu DNA, čo dokázalo, že ctDNA je uvoľňovaná do obehu nádormi.
Hoci vieme, že ctDNA odvodená z nádorových buniek cirkuluje v krvi, pôvod, rýchlosť uvoľňovania a mechanizmus uvoľňovania tejto DNA sú nejasné, pričom výskum prináša konfliktné výsledky. Niektoré výskumy naznačujú, že viac malígnych nádorov obsahuje viac mŕtvych rakovinových buniek a uvoľňuje viac ctDNA. Avšak niektoré výskumy naznačujú, že všetky bunky uvoľňujú ctDNA. Napriek tomu sa zdá, že nádorové nádory uvoľňujú do krvi zvýšené hladiny ctDNA, čím sa ctDNA stáva dobrým biomarkerom rakoviny.
Kvôli ťažkej fragmentácii a nízkym koncentráciám v krvi je ťažké izolovať a analyzovať ctDNA. Existuje rozdiel v koncentráciách ctDNA medzi vzorkami séra a plazmy. Zdá sa, že skôr krvné sérum než krvná plazma je lepším zdrojom ctDNA. V štúdii Umetani a kol. Sa zistilo, že koncentrácie ctDNA sú konzistentne nízke v plazme v porovnaní so sérom v dôsledku možnej straty cirkulujúcej DNA počas čistenia, pretože koagulácia a iné proteíny sa eliminujú počas prípravy vzorky.
Podľa Heitzera a kolegov je tu niekoľko konkrétnych otázok, ktoré je potrebné vyriešiť, aby využili diagnostický potenciál ctDNA:
Po prvé, predanalytické postupy musia byť štandardizované .... Výber metódy izolácie, ktorý zabezpečuje extrakciu dostatočného množstva vysoko kvalitnej DNA, je kritický a ukázalo sa, že preanalytické faktory odberu a spracovania krvi môžu silne ovplyvniť výťažnosť DNA .... Po druhé, jednou z najdôležitejších otázok je nedostatok harmonizácie metód kvantifikácie. Rôzne metódy kvantifikácie, ... produkujú rôzne výsledky, pretože tieto merania sú zamerané buď na celkovú alebo len amplifikovateľnú DNA .... Po tretie, menej je známe o pôvode a podrobnom mechanizme uvoľňovania ctDNA a vo väčšine štúdií sa spájajú udalosti, ktoré môžu tiež prispieť k uvoľneniu ctDNA.
Cielené a necielené prístupy
V súčasnosti existujú dva hlavné prístupy pri analýze krvnej plazmy (alebo séra) pre ctDNA. Prvý prístup je zameraný a hľadá konkrétne genetické zmeny naznačujúce nádory. Druhý prístup nie je cielený a zahŕňa celkovú analýzu genómu, ktorá hľadá ctDNA odrážajúcu rakovinu. Alternatívne sa sekvenovanie exómu používa ako nákladovo efektívnejší, necílený prístup. Exómy sú časti DNA, ktoré sú prepísané na výrobu proteínu.
Pomocou cielených prístupov sa sérum analyzuje na základe známych genetických mutácií v malej sérii mutácií vodiča.
Mutácie vodičov sa týkajú mutácií v genóme, ktoré podporujú alebo "riadia" rast rakovinových buniek. Tieto mutácie zahŕňajú KRAS alebo EGFR .
Vzhľadom na technologický pokrok v posledných rokoch sa cielené prístupy k analýze genómu pre malé množstvá ctDNA stali realizovateľnými. Medzi tieto technológie patrí ARMS (systém refrakčných mutácií amplifikácie); digitálna PCR (dPCR); perličky, emulzie, amplifikácia a magnetické činidlá (BEAMing); a hlboké sekvenovanie (CAPP-Seq).
Napriek tomu, že došlo k pokroku v technológii, ktorá umožňuje cielený prístup, cielený prístup sa zameriava iba na niekoľko pozícií mutácií (hotspots) a chýba veľa mutácií vodiča, ako sú gény na potlačenie nádorov.
Hlavným prínosom necielených prístupov k tekutej biopsii je to, že sa môžu použiť u všetkých pacientov v dôsledku skutočnosti, že test sa nespolieha na opakujúce sa genetické zmeny. Opakujúce sa genetické zmeny nepokrývajú všetky druhy rakoviny a nie sú špecifickými signatúrami rakoviny. Napriek tomu tento prístup nemá analytickú senzitivitu a komplexná analýza nádorových genómov zatiaľ nie je možná.
Treba poznamenať, že cena sekvenovania celého genómu sa podstatne znížila. V roku 2006 bola cena sekvenovania celého genómu približne 300 000 dolárov (USD). Do roku 2017 klesli náklady na približne 1 000 dolárov (USD) na genóm, vrátane reagencií a amortizácie sekvenčných strojov.
Klinická využiteľnosť kvapalinovej biopsie
Počiatočné úsilie o použitie ctDNA bolo diagnostické a porovnateľné hladiny u zdravých pacientov s pacientmi s rakovinou alebo s pacientmi s benígnym ochorením. Výsledky týchto pokusov boli zmiešané, pričom len niektoré štúdie poukazujú na významné rozdiely, ktoré poukazujú na rakovinu, stav bez ochorenia alebo relaps.
Dôvodom, prečo sa ctDNA môže použiť len na určitý čas na diagnostiku rakoviny, je to, že variabilné množstvá ctDNA sú odvodené z nádorov. Nie všetky nádory "zbavujú" DNA v rovnakom množstve. Vo všeobecnosti pokročilejšie, rozšírené nádory vylučujú viac DNA do obehu ako skoré lokalizované nádory. Navyše rôzne typy nádorov odovzdali do obehu rôzne množstvá DNA. Časť cirkulujúcej DNA, ktorá je odvodená z nádoru, je veľmi rozdielna v štúdiách a typoch rakoviny v rozmedzí od 0,01% do 93%. Je dôležité poznamenať, že z nádoru je zvyčajne odvodená len menšia časť ctDNA, zvyčajne pochádza z normálnych tkanív.
Cirkulujúca DNA môže byť použitá ako prognostický marker ochorenia. Cirkulujúca DNA by mohla byť použitá na sledovanie zmien rakoviny v priebehu času. Napríklad jedna štúdia ukázala, že dvojročná miera prežitia u pacientov s kolorektálnym karcinómom (tj počet pacientov, ktorí ešte žijú aspoň dva roky po diagnostikovaní s kolorektálnym karcinómom) a mutácie KRAS hotspot boli 100% u tých, zodpovedajúcej cirkulujúcej DNA. Okrem toho je možné, že v blízkej budúcnosti sa môže cirkulujúca DNA použiť na sledovanie prekanceróznych lézií.
Cirkulujúca DNA môže byť tiež použitá na monitorovanie odpovede na liečbu. Pretože cirkulujúca DNA ponúka lepší celkový obraz genetickej štruktúry nádorov, táto DNA pravdepodobne obsahuje diagnostickú DNA, ktorá môže byť použitá namiesto diagnostických DNA, získaných samotnými nádormi.
Teraz sa pozrime na konkrétne príklady kvapalnej biopsie.
Guardant360
Spoločnosť Guardant Health vyvinula test, ktorý používa sekvenačnú sekvenciu nasledujúcej generácie na profilovú cirkulujúcu DNA pre mutácie a chromozomálne preskupenia pre 73 génov súvisiacich s rakovinou. Guardant Health publikoval štúdiu o užitočnosti tekutinovej biopsie v onkológii. Štúdia použila krvné vzorky od 15 000 pacientov so 50 kombinovanými typmi nádorov.
Výsledky z testu kvapalnej biopsie sú väčšinou porovnateľné s génovými zmenami pozorovanými v biopsiách nádorov.
Podľa NIH:
Gardant360 identifikoval rovnaké kritické mutácie u dôležitých génov súvisiacich s rakovinou, ako sú EGFR, BRAF, KRAS a PIK3CA, pri frekvenciách, ktoré boli veľmi podobné tým, ktoré boli predtým identifikované vo vzorkách nádorovej biopsie a štatisticky korelovali na 94% až 99%.
Okrem toho podľa NIH výskumníci uviedli nasledovné:
V druhej časti štúdie hodnotili výskumníci takmer 400 pacientov - z ktorých väčšina mala pľúcny alebo kolorektálny karcinóm - ktorí mali k dispozícii údaje o krvnej ctDNA a nádorovej DNA a porovnali vzorky genómových zmien. Celková presnosť kvapalnej biopsie v porovnaní s výsledkami analýz nádorovej biopsie bola 87%. Presnosť sa zvýšila na 98%, keď sa vzorky krvi a nádorov odobrali do 6 mesiacov od seba.
Guardant360 bol presný, hoci hladiny cirkulujúcej DNA v krvi boli nízke. Často sa cirkulujúca nádorová DNA skladá z 0,4 percenta DNA v krvi.
Celkovo pomocou tekutej biopsie mohli výskumníci Guardantu identifikovať nádorové markery, ktoré by mohli priamo liečiť lekári u 67% pacientov. Títo pacienti mali nárok na liečbu schválenú FDA, ako aj na liečebné terapie.
ctDNA a rakoviny pľúc
V roku 2016 FDA schválila test mutácie EGFR cobas, ktorý sa má použiť na detekciu mutácií EGFR v cirkulujúcej DNA pacientov s rakovinou pľúc. Tento test bol prvou tekutou biopsiou schválenou FDA a identifikovali pacientov, ktorí môžu byť kandidátmi na liečbu cielenou terapiou používajúcou erlotinib (Tarceva), afatinib (Gilotrif) a gefitinib (Iressa) ako liečbu prvej línie a osimeritinib (Tagrisso) liečba druhej línie. Tieto cielené terapie útočia na rakovinové bunky so špecifickými mutáciami EGFR .
Je dôležité, že kvôli vysokému počtu falošne negatívnych výsledkov FDA odporúča, aby vzorka tkanivovej biopsie bola odobratá aj od pacienta, ktorý má negatívnu tekutú biopsiu.
ctDNA a rakoviny pečene
Počet ľudí, ktorí zomreli na rakovinu pečene, sa za posledných 20 rokov zvýšil. V súčasnosti je rakovina pečene druhou hlavnou príčinou úmrtia na rakovinu vo svete. Nie sú dostupné žiadne dobré biomarkery na detekciu a analýzu rakoviny pečene alebo hepatocelulárnej (HCC). Obehová DNA by mohla byť dobrým biomarkerom pre rakovinu pečene.
Zvážte nasledujúcu citáciu zo strany Lagbaa a spoluautorov o možnosti využitia cirkulujúcej DNA na diagnostiku rakoviny pečene:
Hypermethylácia RASSF1A, p15 a p16 bola navrhnutá ako skoré diagnostické nástroje v retrospektívnej štúdii zahŕňajúcej 50 pacientov s HCC. Podpísanie štyroch aberantly metylovaných génov (APC, GSTP1, RASSF1A a SFRP1) bolo tiež testované na diagnostickú presnosť, zatiaľ čo metylácia RASSF1A bola hlásená ako prognostický biomarker. Nasledujúce štúdie analyzovali ctDNA u pacientov s HCC pomocou technológií hlbokého sekvenovania .... Výrazne boli detekované aberantné kópie DNA kópií na dvoch nosičoch HBV bez predchádzajúcej histórie HCC v čase odberu krvi, ale ktorí počas sledovania vyvinuli HCC. Toto zistenie otvorilo dvere na vyhodnotenie variácie počtu kópií v ctDNA ako skríningový nástroj pre skorú detekciu HCC.
Slovo z
Kvapalné biopsie sú vzrušujúcim novým prístupom k genómovej diagnostike. V súčasnosti sú k dispozícii určité tekuté biopsie, ktoré ponúkajú komplexné molekulárne profilovanie, lekárom, ktoré dopĺňajú genetickú informáciu získanú z biopsie tkaniva. Existujú aj určité tekuté biopsie, ktoré sa môžu použiť namiesto biopsie tkaniva - keď biopsie tkaniva nie sú k dispozícii.
Je dôležité mať na pamäti, že v súčasnosti prebieha veľa testov na tekuté biopsie a je potrebné urobiť viac výskumov, aby sa objasnilo terapeutické využitie tejto intervencie.
> Zdroje:
> Krvný test na genetické zmeny v nádoroch ukazuje sľub ako alternatívu k biopsii tumoru. NIH.
> Heitzer E, Ulz P, Geigl JB. Obehová nádorová DNA ako tekutá biopsia pre rakovinu. Klinická chémia. 2015; 61: 112-123. dva: 10.1373 / clinchem.2014.222679
> Lagbaa J, Villanueva A. Tekutá biopsia v rakovine pečene. Discovery Medicine. 2015, 19 (105): 263-73.
> Tekutá biopsia: Použitie DNA v krvi na detekciu, sledovanie a liečbu rakoviny. NIH.
> Umetani N, et al. Vyššie množstvo voľnej cirkulujúcej DNA v sére než v plazme nie je hlavne spôsobené kontaminovanou cudzorodou DNA počas separácie. Ann NY Acad Sci. 2006, 1075: 299-307.
> Wellstein A. Všeobecné princípy v farmakoterapii rakoviny. In: Brunton LL, Hilal-Dandan R, Knollmann BC. eds. Goodman & Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics, 13e New York, NY: McGraw-Hill.